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上海生工生物工程 常见问题及解答

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  8月17日,在2017年暑期院士专家系列科普讲坛上,中科院院士、原北京大学校长许智宏演讲之后,许智宏院士与陈晓亚院士,黄继荣教授共同就听众关心的问题做了探讨。讨论环节由曾凡一研究员主持。陈晓亚,中科院院士以及第三世界科学院的院士。现任中国科学家上海生命科学院植物生态研究所研究员,上海辰山植物科学研究中心主任.。黄继荣,上海师范大学生命与环境科学学院教授,现任上海市植物生理与分子生物学学会理事长,以及中国植物生理与分子生物学会常务理事。曾凡一,毕业于美国宾夕法尼亚大学,获医学/理学双博士学位,现任上海交通大学医学遗传研究所所长。陈晓亚:目前转基因植物广泛使用一种高度特异性的杀虫蛋白,称为Bt蛋白,其杀虫作用具有三个明显的特征:首先Bt蛋白只能在碱性的昆虫肠道里溶解,而在中性或者酸性条件下不能发挥作用;其次Bt溶解后需要经过专一的酶作用,才能变成具有杀虫能力的产物;第三Bt识别昆虫肠道上皮细胞里特异的受体,两者结合后才能有抗虫的效果。人和高等动物的肠道环境与昆虫不一样,也没有Bt蛋白的受体,因此Bt对人畜是安全的。即便是昆虫,Bt蛋白对棉铃虫这样的鳞翅目昆虫非常有效,但对另外的昆虫,比如蚜虫等,效果可能不明显。之后发展出一种新的RNA干扰抗虫技术,由我们课题组和国外孟山都公司于2007年同时在《自然-生物技术》发表。这种技术是通过在植物中表达一段能与害虫的RNA结合的RNA,达到抑制害虫基因表达的目的。今年美国商务部批准RNA干扰抗虫玉米商业化,主要是抗根虫,估计两年内可以实现商业化生产。曾凡一:我替大家问一个问题:利用植物次生代谢产物,通过转基因技术是否可以完全取代农药?黄继荣:这是一个大家都非常关心的好问题,我认为经过科学家们的不断努力,向自然界学习,这个梦想是可以实现的。首先,我们必须要了解病虫害发生的根本原因,通常情况下病虫害发生与种植单一品种有关,因为在自然界里你很难发现大面积发生病虫害的现象。自然生态系统中植物种类丰富,即使是一个物种,品种类别也很多,而在我们的农田里,往往是一个品种成片种植,植物种类多样性基本消失;相反,自然界中的各种病虫种类依然存在。当农田里种植一个品种的时候,其中的一些病虫就会慢慢地大量繁殖,最后不得不使用农药。因此,病虫害的发生是由我们人工生态系统中缺乏生物多样性引起的。那么,自然界生长的植物凭什么武器来战胜病虫呢,答案就在植物能产生各种各样的次生代谢产物。大家都知道,植物是不会移动的,不像动物可以逃避各种不良环境,如天气太热可到阴凉的地方去或者到空调房里。植物的聪明办法是以不变应万变,通过产生各种代谢产物应对各种逆境包括来自病虫的胁迫。世界上有30多万种植物,中国有3万多种,如果你要去认定这些植物之间有什么不一样,每一种植物至少有一种自己所特有的化合物。一般来讲,每种植物会合成五千种以上的化合物,除了少数是必需的初生代谢产物外,绝大部分是次生代谢产物。次生代谢这个名字不太好,好像不重要,但它们在关键时候起作用。比如说抗热的性状,天热的时候植物会产生一些挥发性的次生代谢产物,带走热量;抗虫的时候,虫子跟我们人一样,有味觉,不喜欢吃苦味的植物。我们可以考虑用转基因技术把植物叶子变成苦的办法来抗虫。譬如,黄瓜的叶子是苦的,水稻、玉米里面就找不到苦味,水稻、玉米被虫咬得很厉害。如果你要把黄瓜苦味相关的基因转到水稻、玉米里,可能虫子就很少了。当然,也可以通过让植物合成一些化合物,来抑制虫子生长或者杀死虫子。此外,我们要认识农药,农药的本质就是一种化合物。你一喷这个化合物,虫子就死掉了。植物能够产生上百万种化合物,但迄今我们从植物中鉴定出来的化合物连冰山一角都没有。这就是应用上的瓶颈问题。所以,现在我们还做不到完全用转基因技术替代农药,我们的农作物还是需要用药,因为我们对植物次生代谢途径的了解非常有限。但是,育种家们已经开始向自然学习,做类似于自然界的园林卫士的工作。一个品种的植株高度、产量、品质都是一样的,但是把不同的抗病虫基因放到植物里去,这样就可以达到自然抗病虫的效果。这个有难度,你要把代谢途径搞清楚,再通过转基因技术,才能够快速高效地达到抗病虫的效果。陈晓亚:次生代谢我补充黄金大米这个例子。大米里维生素含量很低。类胡萝卜素是合成维生素A的前体,缺乏维生素A严重影响人体健康,尤其是视力发育。我国很多地方都存在少年儿童严重缺乏维生素A的情况。黄金大米含有类胡萝卜素,它的推广需要走程序。中国科学家用基因工程的办法,使稻米里产生花青素,花青素有抗氧化的功能。其实西红柿已经有很多胡萝卜素了,但是外国科学家又把花青素引进去,使得西红柿的营养更丰富。曾凡一:我看到在坐有很多小朋友今天也来参加我们的讲坛,非常好。我给小朋友们总结一下黄教授讲的。我们要抗虫,可以通过对水稻进行转基因来实现。农药对环境也不好,有很大的毒性,通过有效转基因,我们不需要打农药,水稻也能生长。那小朋友知道什么叫转基因吗?转基因可以把一个生物体特有的基因转到另外一个生物体里面。最简单的例子,把你爸爸的基因转到你妈妈的身体里面,这是转基因。我们大人讲起来精子转到卵子里面,成为受精卵。我们每个人都是转基因的产物。在转基因这个过程中,爸爸所有的基因转到妈妈所有的基因里面,爱彩彩票两者结合在一起,就成了一个个体,也就生了小朋友你们。但是,科学家们可以不用把所有基因转到另一个植物,只把一种植物的一个或者两个有作用的基因转到另一种植物中。像刚刚讲的,如果水稻生病了,它不能抗虫了,我们转一个能够抗虫的基因到水稻身上,就可以了。这样的话转基因就能为我们服务。我希望这是小朋友可以听懂的东西,你们回家就可以跟你们的同学说我今天知道了转基因。问:能不能把一些药用植物和食用植物进行基因编辑,产生一种既毒副作用小,又可以让人体吸收新植物?陈晓亚:我们现在是在做一些药用植物、药食同源的研究。比如人参,可以用微生物来生产人参皂苷。另外也可以改造番茄,把番茄作为一个反应器,把不同功效的成分在番茄里合成,比如说把甜菜的基因转到番茄里,增加它的保健功能。有报道认为能用烟草生产青蒿酸或者青蒿素。但是这个尝试还在试验阶段。几十万上百万代谢产物,通过生物工程生产一些我们需要的,将来会有很多令人振奋的成果。陈晓亚:在人的肠道中,不论是什么食物总归是一部分降解,一部分被吸收,不光是花青素,其他的成分也是这样的。最近有一篇文章报道,黄酮类化合物通过肠道微生物降解转变成另外一个化合物,这个化合物可以帮助人类抗病毒。这是很有意思的结果。问:很多的报道里面说转基因的负面影响,转基因植物会不会对我们生态有影响,会不会对我们身体有影响?许智宏:大家的担心可以理解。转基因产业化有20年了,这个时间不能算太长,但是世界粮油组织,世界卫生组织等权威的国际组织,包括很多国家政府主管部门都有制度来确保它的安全性。网络媒体不断曝料,说美国谁吃了转基因产品过敏了,但是最后并没有确切的科学证据证明他的过敏是吃了转基因产品导致的。大家担心的问题之一很多就是过敏,实际上哪一种东西都可能导致过敏。我认识一个同事,吃苹果就过敏,另外一个年轻同志讲吃猕猴桃过敏,有很多种植物或其产品都会引起过敏。美国经政府批准的转基因食品由于采用实质等同原则,所以不用标记。但是美国食品只要含有花生就必须标记,因为花生过敏严重的会死人的。我去年在美国一次坐飞机,乘客上去后空姐说,请各位旅客检查一下你的随身行李中有没有含花生的食品,如果有的话请拿出来,因为驾驶舱里有位驾驶员对花生高度过敏。所以食品没有绝对的安全,有很多东西对你没有关系,但对别人可能有关系,或者跟某个人群有关系。大豆缺少含硫氨基酸,所以大豆蛋白营养不是很平衡。科学家希望把巴西坚果中富含含硫氨基酸的蛋白基因转到大豆中,以改善其营养价值,但是科学家很快发现,那种基因编码的蛋白使有的人过敏,所以随即停止了这个项目。在任何一个阶段一旦发现有问题,科学家都应终止这个试验,这是负责任的态度。很多食物都可能对人产生不利。比如,我们到云南吃蘑菇,有几种蘑菇必须煮15分钟,因为有毒素,煮15分钟过后毒素就失活了。国际上有很大的数据库,可以预测可引起过敏的结构,用于避免出现这类问题。网络媒体讲草甘膦致癌,实际上致癌对人体分很多不同档次,每个档次影响不同。要客观来评价,我们今天农业发展不可能不用农药,但是我们要合理利用这些农药,规避它的风险,最大的减少对环境,对人的影响,这才是最关键的。要做到这一点,需要政府的监管部门来进行严格管理。黄继荣:我们吃的所有食物里面都有基因,但是基因本身是没有活性的,DNA是死的,吃下去就被代谢掉了。现在很多人担心Bt蛋白,这个基因编码的蛋白可以杀虫,那会不会对人体有什么伤害?科学家们做了很多的研究,对人肯定是安全的。很多媒体的报道不负责任,人云亦云,不学习新生事物,对原文做篡改。如果你要去看原文的话,就知道事实的真相。当你听到很可怕的事情,不要慌,慌解决不了任何事情。你要主动学习,最好的办法就是向科学家们请教,和他们讨论,这是最好的解决办法。问:转基因食品有没有不安全的?如果是没有的话,为什么还要评估。我们进口的转基因食品只有两种,为什么还要控制?许智宏:经过严格的科学评估后,并依法获得政府批准的转基因食品是安全的。安全与否,有限制范围,如果科学家随便转一个基因,那怎么保障食品安全?转基因作物的鉴定是最严密的,它必须经过很多评估,通过这些过程,才能确定它的产品是安全的。许智宏:欧洲有不少转基因食品。欧洲不少国家虽然禁止种植转基因作物,但允许进口美国的转基因大豆、玉米,作为饲料和食品原料。欧洲不是没有转基因食品,只是欧洲的转基因产品需有标识。但食品中的转基因成分只要不超过0.9%,就如同非转基因食品,无需标识。中国和欧洲不同,采用的是零容忍,只要食品中含转基因成分,即需标识。许智宏:农业部已经大致明确,未来几年中会加快步伐,转基因玉米和大豆要产业化。科学家也不理解,我们自己已有转基因大豆和玉米技术,以及育成的品种材料,为什么不用而要每年进口转基因大豆、玉米?我们希望农业部加快审批,要加快速度,不能老等着。十几年都没有批准过转基因作物了,连阿根廷、巴西、印度都跑到我们前面去了。但这也要有步骤,以美国推广转基因为例,如果美国一上来就做小麦的转基因,肯定会被抵制,毕竟小麦是他们的主粮,但做水稻转基因就没有那么多反对的声音。在我国,按照次序,先非粮作物(棉花),再非主粮作物(饲料和食品加工原料:大豆、玉米),最后再来搞水稻和小麦。这些技术已经储备在那里,走完审批的所有过程,我估计没有五到六年都过不了,我国对转基因的监管应该是全世界最严格的。最近网络媒体讲,无锡有十万人不孕不育,是这几年吃转基因食品的结果。再吃两三代就不得了了,中国有五千万不孕不育,岂不要灭种了?每个人仔细想想,就能发现这是一个谎言,一种误导。现在的确有很多不孕不育,但原因怎么能跟转基因有关?好几年前从广西就传出,广西大学生体检男生精子数减少,认为与吃转基因玉米有关。但调查显示广西没有进口美国转基因玉米种子。大学生体检结果跟吃玉米毫无关系。第二次世界大战以后,特别是在一些发达国家男士精子数目减少、异常率增加,是普遍的现象,但也没有到少到生不出孩子的地步。精子减少很大一部分原因是跟环境污染有关,把什么问题都归结到转基因上面,这是很大的误导。许智宏:到现在为止,没有发现获得批准的转基因食物有什么不安全的。自然界的天然转基因有很多,我举一个例子,我们吃的红薯。两年前国内外科学家合作,检查了很多地区不同品种的红薯,发现所有测试的红薯品种里面都有一段做转基因载体的细菌基因。所以科学家认为所有这些被鉴定的红薯品种都是天然的转基因植物,说明在自然界转基因是经常发生的。可能很多作物已经是转基因植物,只是科学家还没有检查到。问:国家对转基因是不是有很强的控制力,会不会有人私下里去做转基因?许智宏:如果在不是审批同意进行转基因植物田间试验的地方,发现有转基因植物,一旦发现必须销毁。上海市有关部门会进行严格的抽查,是不是在做转基因实验,做的转基因实验要种到田里,是否经过审批。是不是每个省都像上海这么严格,我不知道。但说白了,没获审批的都是违法的,科学家必须知道,没有得到审批我们不能随便把转基因材料种到田里去。黄继荣:上海科委每年都会随机抽检,如果发现没有申报的地方出现转基因植物了,谁种的就会承担相应的责任。上海很严格的。做实验也是一样的,都是非常规范。刚才小朋友讲副作用,唯一副作用就是,现在做转基因都是用抗生素类筛选,这些基因如果随意转移到跟人相关的病原菌里面,就会有麻烦。基因转移是自然现象,人还不能合成一个有功能的基因,现在都是利用自然界已有的基因在做转基因,既然这些基因已经存在,你就不能预防它怎么转,细菌之间、病毒之间基因的转移是没有办法预防的。曾凡一:就像黄教授刚才讲的那样,完成一个转基因不是件很容易的事情,费时也费钱。科学家申请做转基因的工作要先经过几轮专家的认证,通过了认证才会立项,才能有经费,才可以去做。转基因并不是一件随意的事情,需要非常高超的技术,我们国家从源头到后续种植都有严格的管控机制。问:我是一个医生,上个世纪在使用四环素的时候说,又便宜副作用又小,当时也没有说牙齿会变黑,过了十几年二十年以后,牙齿变黑且治不了。转基因技术现在做了将近20年的时间,那么转基因会不会在20、30年以后也出现问题?许智宏:这是两个问题,四环素问题出在滥用。四环素和转基因不一样,做转基因的时候,我们转进去的基因我们知道是什么东西,转基因的基因产物人吃了会有什么后果,我们很清楚,这些都是知道的。比如抗虫基因,抗虫基因这个蛋白,在转基因植物以前,苏芸金杆菌已作为生物农药广泛使用。生物学家早就发现抗虫蛋白对哺乳动物是没有作用的。为什么?因为这个蛋白在昆虫的肠子里的碱性环境中,切成两段成为毒素,昆虫肠子上有受体,毒素和受体结合以后,肠子穿孔,虫子就死掉。而这个蛋白到人的胃里,没有几分钟就会被分解成氨基酸,变成营养物质,再加上人的肠子根本没有虫子的那个受体,所以根本不可能对人发生作用。问:我们老人已经有很多慢性病了,我们到商店到底应该买转基因的还是买非转基因的?许智宏:上海的超市中转基因的大豆油5公斤一桶的是38块,非转基因的68块左右。但我告诉你,现在的工业榨油工艺,不管转基因还是非转基因,油里的那个蛋白已经吃不到。即使你认为转基因抗虫蛋白对人不好,但油里已经检测不到那个蛋白。顾客有选择权,但是我肯定要买转基因的,因为两种油的成分没有差异,我为什么要多花钱买贵的。当然我们国家规定,转基因原料做的我们必须标记。但是我们得知道这个道理,转基因大豆油是安全的,没有问题的。

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  上海生工生物工程 常见问题及解答 常见问题及解答 1.如何测定引物的OD值? 用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的吸光度来定量,请注意紫外分光光度计的使用,测定时溶液的吸光度最好稀释到0.2-0.8之间(吸光度太高或太低会有较大的误差)。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后,取部分溶液稀释到1ml并在1ml标准比色皿中测定其吸光度,即为所测体积的OD值,进而可以计算出母液的OD值。 举例:您拿到一管干粉的DNA,用1ml水溶解成母液,取该母液50μL稀释成1ml并在1ml标准比色杯中测定的吸光度为0.25,说明该50μL中含有0.25OD的DNA,也即说明原来1ml母液中含有5OD的DNA。 2.怎样溶解引物? 我们的的合成报告单给出了每OD引物稀释为100μmoLL(即100pmolul)浓度的加水量,您可以根椐您的实验需要加入适量的无核酸酶的双蒸水(PH6.0)或TE缓冲液(PH 7.5-8.0),开启瓶盖溶解之前最好在3000-4000转分钟 的转速下离心1分钟,防止开盖时引物散失。 3.合成的引物应如何保存 没有溶解的引物非常稳定,可以在-20℃下保存至少1年,溶解好的引物可以事先稀释为100μmoLL的储存液,分装数份保存于-20℃冰箱,可以保存至少半年以上(反复多次冻融会降低使用寿命)。使用前,将浓溶液稀释成工作液(10 pmolml或20 pmolml)后进行实验。 4.如何检测引物的纯度? 实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的一定浓度的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,12个碱基的引物用20%的胶,12-60个碱基的引物用16%的胶,60个碱基的引物用12%的胶,取0.2OD左右的引物,用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和,上样前加热变性(95oC,2mins)。加入尿素的目的一是变性,二是增加样品比重,容易加样。600V电压进行电泳,一定时间后(约2-3小时),剥胶,用荧光TLC板在紫外灯下检测带型,在主带之下没有杂带,说明纯度是好的(有时由于变性不充分,主带之上可能会有条带,乃是引物二级结构条带)。 5.一般的合成的引物在5和3末端有磷酸基团吗 没有,5和3末端均为-OH基。如需要加磷酸基团,订货时请特别注明,此时需收取磷酸化的费用。 6.合成的引物进行PCR反应时无目的带,怎么办 PCR反应失败的原因很多,可以从以下几个方面考虑。 1) 引物和模板是否配对,同源性有多大 2) 引物本身是否有立体结构. 3) PCR反应用试剂是否能正常工作 4) PCR仪是否工作正常 5) PCR反应条件是否合适 如果一切正常,还无法解决问题时,我们可以免费重新合成引物。 7.测定了引物的OD值后发现A260A2801.8,引物的纯度合格吗 由于核酸在260nm附近有强吸收,而蛋白质在280nm附近有强吸收,从生物体内提取核酸时,常用A260A280比值来评价核酸纯度(比值在1.8~2.0之间),这一判断是基于序列中A、G、C、T所占比例大致相同时的结果。而合成的DNARNA则不同,序列很短 (通常在20~30个碱基之间),其中A、G、C、T各种碱基所占比例很不相同,由于各种碱基的摩尔消光系数不同,因此不同碱基构成的引物的A260A280比值也不同, 例如当序列中C、T碱基的含量高时,该比值会大大低于1.8。所以不能用A260A280的比值来判断引物的纯度. 8.上海生工公司可以合成多长的序列? 由于用户和基因拼接的要求,我们很好地合成过不少100碱基左右长度的长片段。因为我们可以提高起始合成数量、加大合成用的试剂量、用PAGE纯化。如果您的实验需要,我们愿意接受110碱基以下的订单。 9.PCR产物经过克隆以后测序发现引物区与合成序列不相符合,怎么办? 我们认为这多数是PCR过程和克隆过程中引入的错误。遇到这种情况,请您: 1) 可以要求我们重新免费合成引物。 2) 重新挑取克隆测序,会有找到正确克隆的可能. 10.如何将两条互补的单链退火形成双链? 用退火缓冲液(10mM Tris, pH 7.5 - 8.0, 50mM NaCl, 1mM EDTA)溶解引物, 将要退火的引物等摩尔数混合,总体积不要超过500微升,加热到95℃ 2mins,然后缓慢冷却至室温(低于30度)即可。退火的产物可以放在4度待用。 11.使用3%的Agarose凝胶电泳分析合成的引物,发现有很多条泳带,为什么 对引物进行电泳一定要使用变性PAGE电泳。由于引物是单链DNA,容易形成复杂的立体结构,因此进行Agarose电泳时,容易出现多条泳带,更无法用Agarose电泳进行定量了。 12.能否根据引物电泳后EB染色后条带的亮度对合成的引物进行定量 不能。因为EB是通过嵌入到核酸的双螺旋间而使其着色的。合成的DNA分子为单链,只有通过自身回折形成局部发夹环结构或链间形成部分双螺旋结构,才能被EB染色。由于不同引物的序列不同,形成双螺旋的能力不同,因此染色能力不尽相同,也就不能根据EB染色带的亮度来对合成的DNA进行定量。 13.2OD的引物可以多少做次PCR反应? 一般来讲,20个碱基左右的2OD的引物最少可以做400次PCR反应。 14. DNA合成粗产物中含有什么杂质? DNA合成仪合成的粗产物,其中除了含有所需的目的DNA片段以外,还含有合成反应过程中产生的目的片段短的失败片段以及脱保护基团产生的铵盐,本公司提供的引物已全部通过纯化去除短片段、通过脱盐去除盐分。 15.引物在常温下运输,会降解吗? 不会降解,干燥的引物在常温至少可以稳定存放二周以上。而一般的运输时间通常都在1-3天,所以您收到的引物不会降解。 16.为何长链引物的收费要比短链引物要高? 通常在合成长链引物时,试剂的加入量要比短链引物要多很多,尤其是大于90bp的碱基以上的引物,由于成本的增加,从而导致价格也要高一些。 PCR产物DNA测序错误的原因 一、Taq酶原因 本公司现为世界上最大的合成DNA专业公司之一,每天为世界各地用户合成约2100条引物。在这些大量的引物中大多用于PCR扩增,约有万分之五左右的在DNA测序后,发现在引物部分有错误,错误大部分表现为丢失。许多用户认为这种错误是我们公司合成错误造成的。 实际上这种错误是由于Taq酶固有的错误概率造成的,与合成无关。请看如下示意图 从图可以清楚的看出,引物部分也被Taq扩增,既然引物也被扩增,那么错误就可能发生。 那么化学合成DNA会不会发生错误呢 回答是否定的。 错误无非有两种一是碱基被置换;二是碱基丢失。本公司的80多台DNA合成仪全部为ABI公司产品,ABI的DNA合成仪是世界上最可靠的,至今尚未听说过ABI的DNA合成仪在合成一个碱基时(例如A),却错误地加上另一个碱基(G,C or T),丢失更不可能。因为DNA合成是在固相上进行的,每一个碱基的合成包含了脱保护基(DMT)、碱基的加成、盖帽(Capping)、氧化等步骤。如果说某一个碱基由于种种原因(如瓶中溶液没有了,或管道堵塞),未加入到正在延伸的Oligo上,那么下一个反应Capping将会把Oligo封死,使整个oligo合成立即中止。 可见,以上PCR产物测序时发生在引物部分的错误不是引物合成的失误,而是Taq酶造成的。 二、化学原因 在合成过程中,如果本公司提供的DNA合成报告单是正确的,表示合成是成功的。人为因素造成碱基突变的可能性是完全可以排除的。DNA合成专家Dr. Hecker和Dr. Rill对此作了一评论 (Error Analysis of Chemically Synthesized Polynucleotides Biotechniques,1998.Feb.24:256-60),认为化学合成的DNA片段要比天然的DNA片段有更多的碱基突变概率。但其真正的化学机理还不太清楚,但可以肯定的是要保证100%不发生错误是不可能的。最近,Dr. Jacek Lubkowski 在《Nucleic Acids Research》(2002,Vol. 30, No. 10 e43) 上发表了一篇文章也证实了化学合成引物(非人为错误)会导致错误,而且引物链越长,错误概率越高。原文如下:while this method is simple in principle, in practice numerous complications can lead to errors in the synthesis. To reduce the possibility of errors during oligonucleotide synthesis, the oligonucleotides should be rather short, yet they must still be long enough to provide stable priming overlaps. 三、解决的办法 1. 建议用高保真的高温聚合酶,如本公司推出的Super Pfu、Pfu 、Taq plus等,保线倍左右,可有效的减少差错。 2. 再挑选一个克隆进行DNA测序,一般来说再次出现错误的可能性就更小了。 3. 重新合成引物。 4. 将您有缺失碱基的克隆送到我们基因部,我们负责将缺失的碱基进行点突变,提供您所需要得正确序列。 但由于客户的载体非常复杂和多变,我们承诺的是提供 DNA损伤的来源 1.1 碱基脱落形成AP位点 热和酸等都可使嘌呤和嘧啶从DNA链的核糖磷酸骨架上脱落,形成AP位点(Apurinic orApyrimidinic site )。 烷化鸟嘌呤的糖苷键不稳定,容易脱落形成DNA上无碱基的位点。 1.2 碱基的改变 ①物理因素 电离辐射可引起其它物质产生自由基,从而引起碱基氧化修饰、过氧化物的形成、碱基环的破坏和脱落等。 一般嘧啶比嘌呤更敏感。 ②化学因素 a. 烷化剂 硫酸二甲酯、甲烷磺酸甲酯(MMS)等烷化剂可将烷基加到嘌呤或嘧啶的N或O上使碱基烷基化。 鸟嘌呤的N7和腺嘌呤的N3最容易受攻击,形成m7G和m3A烷基化的嘌呤碱基,导致复制时碱基错配。 例如鸟嘌呤N7被烷化后会与T配对,结果会使G-C转变成A-T。 b. 碱基类似物 5-溴尿嘧啶(5-BU)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、2-氨基腺嘌呤(2-AP)等。它们的结构与碱基相似,进入细胞能替代正常的碱基参入到DNA链中而干扰DNA复制合成。 如5-BU与T结构相似,在酮式结构时与A配对;它更易成为烯醇式结构与G配对,在DNA复制时导致A-T转换为G-C。 c. 黄曲霉素 黄曲霉素B、1,2-乙酰-氨基芴、苯并芘、吖啶等可插入碱基序列,引起移码。 d. 硝酸盐 亚硝酸盐能使C脱氨变成U,经过复制就可使DNA上的G-C变成A-T对。 ③碱基的自发改变和损伤 a. 碱基的异构互变 4种碱基各自的异构体间都可自发地互变(烯醇式与酮式间的互变),这会使碱基间发生错配,使A-C、T-G等。 b. 碱基的脱氨基作用 碱基的环外NH2有时会自发脱落,使C→U、A→次黄嘌呤(I)、G→黄嘌呤(X)等,DNA复制时,U-A、I-X、I-C配对,导致子代DNA序列错误。 5-甲基胞嘧啶脱氨基产生T(引起C-G→T-A的变化),而C脱氨基产生U(它通常被移出或被C代替)。 ④氧自由基伤害 细胞代谢副产物O2-、H2O2等会造成碱基损伤,产生胸腺嘧啶乙二醇、羟甲基尿嘧啶等碱基修饰物,引起碱基配对错误。 1.3 碱基插入或缺失 吖啶类分子带正电呈扁平状,易于嵌入DNA碱基平面间,导致在复制或重组过程中缺失或插入一个碱基。 DNA聚合酶在复制过程中发生滑动,尤其在连续几个相同碱基的区段产生1个或几个碱基的缺失或插入。聚合酶在模板链上滑动易于造成缺失,在生长链上滑动易于造成插入。 插入或缺失会导致读码框改变。 1.4 嘧啶二聚体 DNA受到紫外线照射时,使DNA链上相邻的嘧啶以共价键连成二聚体。 相邻2个T;或2个C;或C与T间都可形成环丁基二聚体;相邻2个T间最易形成TT二聚体。 1.5 DNA链断裂 电离辐射可使DNA链断裂;射线的直接和间接作用都可能使脱氧核糖破坏或磷酸二酯键断开而致DNA链断裂。 烷化剂也可使DNA链断裂;DNA链的磷酸二酯键上的氧易被烷化,结果形成不稳定的磷酸三酯键,在糖与磷酸间发生水解,使DNA链断裂。 对单倍体细胞一个双链断裂就是致死性事件。

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