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(1)选择原则应考虑到药物临床疗效、耐药菌株流

(1)选择原则应考虑到药物临床疗效、耐药菌株流

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  细菌感染威胁着人类的生存。1928年Flemming发现了青霉素,1941用于临床,细菌性疾病的治疗从此进入了抗生素时代。抗生素这一“神奇的药物”曾使人类有效控制了许多可怕的细菌感染性疾病,发病率和死亡率明显下降。然而进入20世纪80年代,细菌感染并不因为抗菌药物的广泛使用而减少,而是出现了更多的细菌感染;更令人担忧的是,越来越多的细菌产生了耐药性,甚至多重耐药性,变得愈加难以对付,成为人类健康事业面临的严重问题之一。

  耐药性(drug resistance)是指细菌对药物所具有的相对的抵抗力。耐药性的程度依该药对细菌的最小抑菌浓度(MIC)表示。

  来源于该细菌本身染色体上的耐药基因,代代相传,具有典型的种属特异性。

  由于细菌在生长繁殖过程中,其DNA发生改变而使其形成获得了耐药性

  细菌耐药性监测对准确掌握细菌对抗菌药物的耐药动向和耐药性变迁,并指导临床合理用药具有重要的意义。近年来抗菌药物的广泛应用,引起了耐药菌株的大量产生。但新的抗感染药品问世速度远赶不上细菌变异产生的耐药性速度。还有新发传染病及其病原体的不断涌现都说明了细菌耐药性试验的重要性。

  测定抗菌药物在体外对病原微生物有无抑制作用的方法称为药物敏感性试验,简称药敏试验。

  (1)选择原则应考虑到药物临床疗效、耐药菌株流行情况、预防耐药菌株产生和经济的综合因素,最终目的是达到控制感染。

  含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上,纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散,形成递减的浓度梯度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制,形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度,并与该药对测试菌的最低抑菌浓度(MIC)呈负相关,即抑菌圈愈大,MIC愈小。

  E试条是一条 5mm×50mm的无孔试剂载体,一面固定有预先制备的,浓度呈连续指数增长稀释抗生素,另一面有读数和判别的刻度。将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上,经孵育过夜,围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈,圈的边缘与试条交点的刻度浓度即为抗生素抑制细菌的特定浓度,又称抑制浓度(IC),它与MIC呈高度相关。

  以一定浓度的抗菌药物与含有被试菌株的培养基进行一系列不同倍数稀释(通常为双倍稀释),经培养后观察最低抑菌浓度。包括肉汤稀释法、微量肉汤稀释法和琼脂稀释法。

  琼脂选择法是将药物混匀于琼脂培养基中,配制含不同浓度药物平板,使用多头接种器接种细菌,经孵育后观察细菌生长情况,以抑制细菌生长的琼脂平板所含药物浓度测得MIC。结果判断将平板置于暗色、无反光表面上判断试验终点,以抑制细菌生长的药物稀释度为终点浓度(磺胺可见少许散在细菌生长)。

  试验菌的结果报告可用MIC(g/mL)或用敏感(S)、中介(I)和耐药(R)报告。爱彩彩票

  “敏感”即表示测试菌可被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制;“耐药”即表示测试菌不能被在体内感染部位可能达到的抗菌药物浓度所抑制,临床治疗无效;“中介”者提示该细菌对常规用药体液或组织中的药物浓度的反应率低于敏感株,使用高于正常给药量有疗效。

  排列无菌试管10只,于2~10 只管中加无菌蒸馏水10 mL,取50%(1∶2)乌梅水煎液20 mL,于第一管加入10 mL,第2 管加入10 mL,于第2 管混合后取出10 mL,加入第3 管,再混合后取10 mL 放入第4 管,如此连续稀释至第9 管取出10 mL 弃掉。第10 管只有无菌蒸馏水作对照。这样1~9管中含有不同浓度药液各10 mL。

  将已溶化的无菌M-H 琼脂900 mL 分装于10瓶,每瓶90mL,将第1管含10 mL 50%的乌梅水煎液放入含90mL 培养基的瓶中,混合后倾注4个平板,每个平板含25 mL 含药琼脂,第2管以后的平板制备同第1管,凝固后备用。这样第1组的琼脂平板实际含乌梅5%(1∶20),第2 组为1∶40,第3 组为1∶80。含药培养基的药物浓度计算:将一定量(50 mL 或100 mL)、一定比例(1∶2 或1∶4)的原药材水煎液于37 ℃温箱中烘干,称重,求出每1 mL 水煎液的实际重量,就可算出每1 mL 培养基中水煎药液干重量。如每100 mL 50%乌梅煎液干重为11500 mg,第1组每100 mL含药培养基含有煎液10 mL,那么每1 mL 培养基含煎液干重则为:

  将金黄色葡萄球菌等新鲜培养物(菌落)制成菌液,浓度相当于0.5麦氏比浊管。

  用多点接种仪分别吸取各种菌液并将其点种于含不同药物浓度琼脂平板上。于35 ℃培养18~24 h,观察最低抑菌浓度

  根据现有大量的具有强耐药性细菌的出现,被测试的药物种类以及其浓度范围都再不断的扩大,这都加重了实验人员的工作量,这也是琼脂稀释法最大的缺点,另外传统的接种方法,接种效果较差,准确性和重复性都很低。

  我公司自主研发的HMI-60型多点种仪为细菌耐药性实验量身打造的仪器,可以在9秒钟内自动进行并完成接种,且一次性可进行多种药物及其不同浓度的接种试验。打破了传统人工接种模式,采用全自动机械接种,使接种过程简单、快速,准确。

  l 接种棒使用经特殊处理的不锈钢制成,由于专门的结构设计和特殊加工,消除了接种棒的疏水性并防止了采样时菌液滴落。

  l 具有位置判定针,培养皿上的菌落位置很容易判定,灭菌处理方法简单。

  l 采菌液量准确重现性高,可靠性高的检测手段,采菌量准确确保所有接种棒在培养皿上成功接种。

  l 操作简单快速接种速度快且可调,实现了快速检测菌液稀释的简易操作,减轻工作强度并避免操作误差。

  l 独特的可调速旋转式样品托盘可实现自动定位无需操作只需要更换样品即可完成接种,极大的缩短了操作时间,满足了实验室自动化的要求。

  HMI系列多点接种仪根据接种针数目不同分为HMI-24、 HMI-60和HMI-96.其中HMI-24的接种菌液量为3L,而其它两种均为1L,可根据实验中配置系列药物浓度的多少进行选择。

  克服了传统细菌接种方法的诸多缺点,如由于接种环结构以及每个接种环之间的差异而导致采菌液量不准确和由于重复性差所导致的裁定药物抗菌浓度的不准确等缺点。

  标配:24位接种架(含24支接种棒,1支位置针,24位样本定位盒);60位接种架(含60支接种棒,1支位置针,60位样本定位盒);选配:96位接种架(含96支接种棒,96位样本定位盒)。

  主要用于细菌耐药性实验。广泛应用于药物检测,药品生产、药物研发、疾病防控等医药领域。

  在对阿莫西林-双氯西林的体外抗菌作用研究中,收集临床分离菌按CL SI/ NCCLS推荐的琼脂对倍稀释法测定阿莫西林-双氯西林的最低抑菌浓度,并与相关抗菌药物进行比较。MIC的测定方法为按 NCCLS2005 年版推荐的琼脂对倍稀释法测定9 种抗菌药的最低抑菌浓度。抗菌药的保存液和工作液配置均按CL SI/NCCLS 2005年版的描述进行。药物浓度从128~0.06 mg/L共12个对倍稀释度,细菌的接种菌量为104CFU/点。使用多点接种器接种35℃培养16~18h。

  在对2002-2003年中国革兰阴性细菌耐药性监测研究中,采用国际标准平皿二倍稀释法进行体外敏感试验,测得MIC50、MIC90表示抗菌药物的抗菌活性。最低抑菌浓度(MIC)测定:用标准琼脂二倍稀释法测定MIC,根据不同菌种选择适宜培养基。用多点接种仪定量接种细菌,根据所测每株菌 MIC值,计算 MIC50与 MIC90,并按 NC CLS 2002 规定的临界浓度,判定每株菌对抗菌药物的敏感度,求出各类细菌对所测定的各种抗菌药物的R %、I%和S%。

  在对利奈唑胺对万古霉素敏感及耐药屎肠球菌的抗菌活性研究中,多重的PCR 法鉴定屎肠球菌万古霉素耐药基因类型,平皿二倍稀释法测定利奈唑胺等11种抗菌药物MIC值。采用标准平皿二倍稀释法。被试菌悬液用多点接种仪接种,每点接种量为104CFU/mL。按照CLSI判定细菌对各种抗菌药物的敏感、中介和耐药率,其中高浓度庆大霉素和高浓度链霉素敏感性的判断标准为:庆大霉素500mg/L为敏感,500mg/为耐药;链霉素2000mg/L为敏感,2000mg/L为耐药。

  中国九家教学医院肠杆菌科细菌质粒介导的喹诺酮耐药机制研究中,究质粒介导的喹喏酮类的耐药基因qnr和缸aac(6)-lb-cr在我国肠杆菌科临床株中的分布状况。其方法主要分为qur筛选、aac(6)-lb-cr的检测和质粒接合实验,其中在在筛选平皿上生长的菌落同时采用细胞接种仪接种至含及不含环丙沙星(0.05g/mL)的M-H平皿,以了解喹诺酮类耐药是否同时转移。

  在对乌梅对308株临床菌株的抑菌效果研究中,采用琼脂稀释法对乌梅进行308株临床菌株的抑菌活性检测,采用多点接种仪进行指标检测,具体步骤为用多点接种仪分别吸取各种菌液并将其点钟于含不同药物浓度琼脂板上。于35℃培养18-24h,观察最低抑菌浓度(MIC),并统计出MIC50和MIC90的药物浓度和累积抑菌百分率。

  (6)《苦参、黄芩、乌梅对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和白假丝酵母菌抗菌活性研究》

  在对苦参、黄芩、乌梅对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和白假丝酵母菌抗菌活性的研究中,采用M-H琼脂连续稀释法做抗菌作用测定,测出各中药的最小抑菌浓度。在进行MIC测定时使用多点接种仪分别吸取各种受试菌菌液并在15min内将其点种于含不同药物的琼脂板上,于37℃在培养箱中培养18-24h,观察含药平板的菌落生长情况,根据含药平板的菌落抑制数,以平板内细菌全部被抑的药物最低浓度作为对该菌株的最小抑菌浓度即MIC值。

  肉汤稀释法:CAMHB;2%NaCL+CAMHB 用于检测苯唑西林、甲氧西林、萘夫西林;

  琼脂稀释法:Mueller-Hinton琼脂;2%NaCL+MHA用于检测苯唑西林、甲氧西林、萘夫西林

  352℃;空气;16-18 小时;测苯唑西林、甲氧西林、萘夫西林和万古霉素需24 小时。试验温度超过35℃不能检测MRS。

  金黄色葡萄球菌ATCC29213;大肠埃希菌ATCC 35218(为监控-内酰胺酶/-内酰胺抑制剂纸片用);金黄色葡萄球菌ATCCBAA-977 和金黄色葡萄球菌ATCCBAA-976(用于克林霉素诱导试验质量评估)

  含5%绵羊血的Mueller-Hinton 琼脂;CAMHB+2~5%融解的马血;MHA+5%脱纤维羊血

  直接菌落悬液法,相当于0.5 麦氏标准(纸片扩散法);来自20-24小时CO2环境巧克力平板的直接菌落悬液法,相当于0.5 麦氏标准(液体稀释法、琼脂稀释法)。

  肺炎链球菌ATCC49619,5%CO2 环境;大肠埃希菌ATCC25922(在空气或5%CO2 环境)用于环丙沙星、萘啶酸和米诺环素监控

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